Цель курса – познакомить студентов, специализирующихся в области зоологии, с теми подходами и методами современной молекулярной биологии и генетики, которые они смогут использовать в своих зоологических исследованиях для решения вопросов филогении, систематики и экологии животных.
Спецкурс включает теоретический и практический разделы. Задача теоретического раздела – познакомить студентов с основными направлениями и подходами молекулярной систематики, филогеографии, молекулярной экологии и научить ориентироваться в соответствующей литературе. Практическая часть курса подразделяется на экспериментальную работу в молекулярно-генетической лаборатории и освоение основ биоинформатики. Во-первых, предполагается дать студентам основные практические навыки по работе с ДНК животных, такие как выделение ДНК, горизонтальный и вертикальный электрофорез ДНК в гелях, работа на спектрофотометре, ПЦР, пробоподготовка к автоматическому секвенированию по Сэнгеру, рестриктазный и микросателлитный анализ. Во-вторых, научить обрабатывать и анализировать сиквенсы, пользоваться базой ГенБанка, применять основные методики и алгоритмы филогенетического и филогеографического анализа на практике. Предполагается, что освоение лабораторных и биоинформатических методик происходит в процессе выполнения студентами конкретных задач по генетической диагностике, филогении и филогеографии, поиску гибридов и генетическому определению пола. Форма итоговой отчётности — экзамен.
Общий план лекций и компьютерных семинаров:
- Вводная часть. Предмет молекулярной систематики и экологии. Чем отличаются молекулярно-генетические признаки от фенотипических? Молекулярные конвергенци. Признаки и их состояния при работе с разными молекулярными маркерами. Интегральные методы фрагментного анализа ДНК. Секвенирование индивидуальных генов. Редкие геномные изменения. Анализ полных геномов. Влияние молекулярно-генетических подходов в зоологии на систематику, экологию и этологию. Роль генетических методов в систематике, филогенетике и популяционной генетике. Генетическая концепция вида. Баркодинг. Генетика и социальное поведение. Структура популяции, миграции, межпопуляционный обмен генов, демографическая история. Практическое использование молекулярных маркеров (оценка численности, определение пола, родства, проблемы интродукции и разведения).
- «Молекулярная кухня»: практические методы молекулярной систематики.
2.1. Сбор и консервация проб для генетического анализа. Методы выделения ДНК. Работа с исторической и древней ДНК. ПЦР – полимеразная цепная реакция амплификации ДНК: история, сущность, разнообразие методов ПЦР. Разнообразие ПЦР-подходов к изучению генетической изменчивости: RAPD, AFLP, ПЦР-ПДРФ. Саузерн-гибридизация и классический фингерпринт.
2.2. Секвенирование. Секвенирование по Максаму-Гилберту. Cеквенирование по Сэнгеру. Секвенирование полных геномов. История и основные технологии NGS. Секвенирование через нанопоры. Пиросеквенирование. Основные доступные платформы: Roche-454, Solexa/Illumina, SOLID, Ion Torrent.
- Митохондриальные и У-хромосомные маркеры в систематике, филогеографии и популяционной экологии.
3.1. Симбиотическая теория происхождения митохондрий и строение мтДНК. Свойства мтДНК, объясняющие ее популярность в филогеографии и популяционной генетике. Почему мтДНК – не идеальный инструмент молекулярной систематики и экологии? Проблемы при работе с мтДНК. Сравнение эволюции мтДНК у птиц, млекопитающих и беспозвоночных. Белок-кодирующие гены и контрольный регион мтДНК и особенности использования этих молекулярных маркеров. Маркеры У-хромосомы.
3.2. Филогеография. Определение, основные понятия и подходы («поиск основателя»). Структура и результат филогеографического исследования на примере филогеографии человека: митохондриальная Ева и У-хромосомный Адам; расселение человека по маркерам мтДНК и У-хр. Филогения человека по митохондриальным и ядерным геномам: кроманьонцы, неандертальцы и денисовцы.
3.3. Оценка молекулярно-генетического разнообразия и филогеографический анализ. Эффективная численность, нуклеотидное и гаплотипическое разнообразие. Тесты на нейтральность и модели популяционного роста. Примеры филогеографических исследований видов наземных позвоночных. Филогеографические «правила» Эвайса. Гибридизация в природе и генетическая интрогрессия.
3.4. Сортировка генетических линий и анцестральный полиморфизм. Историческая демография и теория коалесценции.
- Белок-кодирующие гены ядерной ДНК в филогенетическом анализе. Чем ядерные гены лучше генов мтДНК в филогенетических и филогеографических исследованиях? Полиморфизм яДНК. Анцестральный полиморфизм в ядерном геноме. Глубокие коалесценции. Понятие видового дерева. Причины несовпадения генных и видовых деревьев. Другие проблемы филогенетических реконструкций по ядерным генам: ортологичные гены и псевдогены; генные дупликации; процессированные псевдогены; ядерно-митохондриальные псевдогены.
- Повторяющиеся последовательности яДНК как нейтральные маркеры эволюции.
Сателлитная ДНК и гипотезы концертной эволюции сателлитных повторов. Микросателлитные маркеры и монолокусный микросателлитный анализ в популяционных исследованиях.
Диспергированные повторы ДНК как инструмент филогенетики. SINEs и LINEs. Методы использования коротких и длинных ретропозонов в филогенетических исследованиях. Потенциальные источники ошибок и двусмысленных толкований этих данных.
- Молекулярная филогенетика для user-ов: последовательности, деревья, модели, методы. Основные понятия и терминология филогенетики: дерево, внешняя группа, разрешенное дерево, полная и частичная политомия; монофилия, парафилия и полифилия. Консенсусное и суммарное генное дерево. Подбор и организация данных, выравнивание, выбор метода анализа и модели, анализ партиций. Методы калькуляции филогенетических деревьев: дистанционные (метод «ближайшего соседа») и методы поиска деревьев (парсимония, максимальное правдоподобие, Байесовские методы). Модели эволюции нуклеотидных замен. Бутстрэп-анализ.
- 7. Молекулярные часы: прошлое и настоящее. Открытие молекулярных часов. Теория нейтральности Motoo Kimura и Тomoko Ohta. Скорость эволюции и факторы, на нее влияющие. Молекулярные часы и филогенетика. Критика теории нейтральности и концепции молекулярных часов. Строгие часы. Что делать, если гипотеза о постоянстве скорости эволюции отвергнута? Локальные часы и свободные часы. Калибровка часов. Причины стохастических и систематических ошибок молекулярного определения времен. Примеры получения молекулярных датировок.
- Молекулярная систематика основных групп позвоночных. Таксономические системы млекопитающих, птиц, амфибий и рептилий по молекулярным данным.
План семинаров по биоинформатике в рамках лекционного курса
- Работа с ГенБанком и сиквенсами из ГенБанка в программе BioEdit.
- Сборка сырых сиквенсов, полученных в результате практических занятиях в лаборатории в программе SeqMan, выравнивание последовательностей и работа с ними в программе BioEdit.
- Практическое знакомство с филогенетическими алгоритмами построения деревьев и медианных сетей (метод «ближайшего соседа», парсимония – в программе PAUP, максимальное правдоподобие – в программе MEGA, Байесов анализ – в программе MrBayes, медианная сеть – в программе Network).
- Построение филогенетических деревьев по индивидуальным генам, получение бутстрэп-поддержек и рассчет генетических дистанций.
Список возможных практических задач для выполнения в лаборатории:
Задача 1 — Выделение ДНК фенол-хлороформным методом из крови птиц и различных тканей млекопитающих, амфибий и рептилий (2 занятия).
Аналитический форез ДНК в агарозе (1 занятие).
Задача 2 — ПЦР-диагностика пола у птиц с помощью ядерного гена хромохеликазы (1-2 занятия).
Задача 3 – генетическая диагностика криптических видов, таксономическая диагностика или выявление гибридов методом ПЦР-типирования, ПЦР-ПДРФ и прямым секвенированием митохондриальных и ядерных генов (1-2 занятия).
Задача 4 – семейный анализ на основе нескольких микросателлитных локусов: ПЦР, вертикальный форез в полиакриламидном геле или автоматическое разделение фрагментов.
Литература
Антонов А.С., 2006. Геносистематика растений. Москва, 2006.
Абрамсон Н.И., 2006. Филогеография: итоги, проблемы, перспективы. Вестник ВОГиС. Т. 11. № 2. С.307-331.
Банникова А.А., 2004. Молекулярная филогенетика и современная систематика млекопитающих // Журнал общей биологии. Т. 65. В. 4. С. 278-305.
Балакирев Е.С., Айала Ф.Дж., 2004. Псевдогены: консервация структуры, экспрессия и функции // Журнал общей биологии. Т. 65. В. 4. С. 306-321.
Гречко В.В., 2002. Молекулярные маркеры ДНК в изучении филогении и систематики // Генетика. Т. 38. № 8. С. 1013-1033.
Лукашов В.В., 2009.Молекулярная эволюция и филогенетический анализ. М.: Бином
Крамеров Д.А., Васецкий Н.С., 2009. Короткие ретропозоны и их использование в филогенетических исследованиях. Молекулярная Биология, т.43, № 5б С.795-806.
Хедрик Ф. 2003. Генетика популяций. Издательство: Техносфера. 592 с.
Холодова М.В., 2009. Сравнительная филогеография: молекулярные методы, экологическое осмысление. Молекулярная Биология, 43 (5), 910-917.
Кимура М., 1985. Молекулярная эволюция: теория нейтральности.
Avise J.C., 2000. Phylogeography: The history and formation of species.
Donoghue PCJ, Yang Z., 2016 The evolution of methods for establishing evolutionary timescales. Phil. Trans. R. Soc. B 371: 20160020.http://dx.doi.org/10.1098/rstb.2016.0020
Hebert P.D.N., Alina Cywinska, Shelley L. Ball and Jeremy R. deWaard, 2013. Biological identifications through DNA barcodes. Proc. R. Soc. Lond. B 2003 270, doi: 10.1098/rspb.2002.2218
Hillis D.M., Moritz C. (eds.), 1996. Molecular systematics. 2-d ed.
Hewitt G.M., 2001. Speciation, hybrid zones and phylogeography – or seeing genes in space and time. Molecular Ecology V. 10. P. 537-549.
Nichols R., 2001. Gene trees and species trees are not the same//TRENDS in Ecology & Evolution Vol.16 No.7.
Shedlock A.M., Okada N., 2000. SINE insertions: powerful tools for molecular systematics. BioEssays. V. 22. № 2. P. 148-160.
Salemi M. & A-M Vandamme, 2005. The Phylogenetic Handbook.
Schmitt T., 2007. Molecular biogeography of Europe: Pleistocene cycles and postglacial trends Frontiers in Zoology, 4:11. doi:10.1186/1742-9994-4-11.
Составитель – доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Анна Андреевна Банникова